Utilização de substâncias antioxidantes (alfa-tocoferol e ternatina) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos

Abstract

O objetivo foi avaliar os efeitos do α-tocoferol e da ternatina sobre morfologia, ativação e crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro e realizar uma revisão de literatura sobre temas relacionados com a origem do estresse oxidativo e das espécies reativas de oxigênio, bem como os mecanismos protetores contra os radicais livres, as implicações destes no ovário e embrião mamífero e o papel do óxido nítrico neste processo. No primeiro trabalho, o córtex ovariano foi dividido em fragmentos, sendo um destes imediatamente fixado (controle). O restante dos fragmentos foi cultivado in vitro por 1 ou 5 dias a 39oC e 5% CO2, em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado e adicionado ou não de 5, 10 ou 15 µM de α-tocoferol ou ternatina. Os fragmentos do controle, bem como os cultivados, foram fixados em 10% de formol ou em 2% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em 0,1M de tampão cacodilato de sódio para análise histológica e ultra-estrutural, respectivamente. Os folículos foram classificados em primordiais ou em desenvolvimento, bem como em normais ou degenerados. Quando comparados com o controle, o cultivo in vitro levou a uma redução nas percentagens de folículos pré-antrais morfologicamente normais em todos os tratamentos com α-tocoferol ou ternatina (P < 0,05), após 5 dias de cultivo. No entanto, quando comparado com o controle, o cultivo de córtex ovariano, por 5 dias, aumentou as taxas de ativação folicular em todos os tratamentos (P < 0,05). Em comparação com o MEM sozinho, a adição de α-tocoferol ou ternatina no meio de cultivo não influenciou a ativação folicular (P > 0,05), exceto no dia 1 de cultivo, quando as concentrações de 5 e 15  µM foram utilizadas, respectivamente, e mostraram um aumento significativo nos percentuais de ativação folicular, em comparação aos outros tratamentos. A análise ultra-estrutural mostrou que folículos cultivados por 5 dias em meio contendo antioxidantes estavam degenerados. Esta degeneração não ocorreu nos folículos tratados apenas com MEM ou no  controle, os quais mantiveram sua integridade ultra-estrutural. Em conclusão, este trabalho demonstrou que α-tocoferol e ternatina podem promover ativação folicular, no entanto, a adição destes antioxidantes nas concentrações testadas reduziu a viabilidade folicular após o cultivo in vitro. No segundo trabalho, verificou-se que as espécies reativas de oxigênio (EROs) ou de nitrogênio (ERN) ou radicais livres são produtos do metabolismo orgânico normal e seu acúmulo pode gerar o estresse oxidativo. Este, por sua vez, causa injúrias celulares podendo levá-las à morte, estando este processo envolvido com a degeneração e/ou apoptose celular durante o desenvolvimento embrionário e em diferentes órgãos, como o ovário mamífero. No ovário de camundongas são produzidas EROs durante a regressão luteal, e estas estão envolvidas no processo de ativação folicular e retomada espontânea da meiose em oócitos. Embora sejam produzidos durante processos fisiológicos, o acúmulo de radicais livres no ovário mamífero pode desencadear patologias. No embrião, os radicais livres são produzidos normalmente devido ao metabolismo normal. Porém em ambientes in vitro com altas concentrações de oxigênio, o desenvolvimento do embrião pode ser prejudicado. O óxido nítrico é considerado um radical livre e participa de processos patológicos e fisiológicos como inflamação, ovulação, implantação embrionária e contração uterina. Para proteger os sistemas biológicos dos danos celulares causados pelos radicais livres, o organismo utiliza enzimas como catalase, superóxido-dismutase e glutationa peroxidase, e mecanismos que incluem substâncias antioxidantes tais como vitamina C, vitamina E, β-caroteno dentre outras.