Apoptose em embriões bovinos em estágio de pré-implantação submetidos ao estresse térmico e ao fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa)

Resumen

Foi avaliada a hipótese de que o estresse térmico e TNF-α induzem apoptose em embriões bovinos em estágio de pré-implantação através de um mecanismo dependente da caspase-9. O Experimento 1 determinou se o inibidor de caspase-9 z-LEHD-fmk bloqueia os efeitos apoptóticos de estresse térmico e TNF-α. Embriões foram coletados nos dia 4, 5 e 6 após FIV e transferidos para um novo meio contendo 100 µM z-LEHD-fmk reconstituído em 0,5% (v/v) DMSO ou DMSO apenas, sendo mantidos em 1) 38,5°C por 24 h (controle), 2) 41°C por 15 h seguido de 38,5°C por 9 h ou 3) 38,5°C por 24 h com 10 ng/mL TNF-α de rato. A proporção de blastômeros que apresentaram apoptose foi determinada por TUNEL.  O experimento foi repetido 4-5 vezes usando 172-248 embriões/dia. Nos embriões mantidos a 41 °C por 15 h e nos tratados com TNF-α por 24 h na ausência do inibidor z-LEHD-fmk, houve um aumento nas células TUNEL-positivas comparando com os embriões cultivados a 38,5 °C por 24 h (P<0.0001). Entretanto, nos embriões cultivados a 41 °C e os cultivados com TNF-α na presença do inibidor de caspase-9 z-LEHD-fmk não se observou aumento nas células apoptóticas (P < 0,01; Treat. X Inhib. P= 0,01). Não houve efeito em relação ao dia. O Experimento 2 testou os efeitos de diferentes concentrações de z-LEHD-fmk nas respostas apoptóticas dos embriões ao TNF-α. Embriões com ≥16 céelulas foram coletados no dia 6 e cultivados z-LEHD-fmk  nas concentrações 0 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM reconstituído em 0,5% (v/v) DMSO) ± 10 ng/mL TNF-α. Após 24 h a 38,5°C, os embriões foram lavados, fixados e analisados por TUNEL. O experimento foi repetido 4 vezes (176 embriões). A adição de 10 ng/mL TNF-α aumentou a porcentagem de células que foram TUNEL-positivas e este aumento foi bloqueado por todas as concentrações de z-LEHD-fmk (concentração x z-LEHD-fmk; P < 0,05). Para o experimento 3, analisamos se o estresse térmico aumenta a atividade da caspase-9 e se z-LEHD-fmk bloqueia este efeito. Embriões no estágio de mórula ou blastocisto inicial foram coletados no dia 6 e transferidos para um novo meio de KSOM-BE2 contendo 100 µM z-LEHD-fmk ou DMSO. Estes embriões foram cultivados a 38,5 °C por 24 h ou a 41 °C por 15 h, seguido de 9 h  a 38,5 °C. Ao fim do estresse térmico, os embriões  foram lavados e incubados em 5 µM CaspaLux 9-M1D2  a temperatura ambiente por 1 h no escuro. A atividade da caspase-9 foi classificada como baixa, média ou alta de acordo com a fluorescência exibida por cada embrião. O estresse térmico aumentou a porcentagem the embriões classificados como tendo média ou alta atividade da caspase-9 e o inibidor z-LEHD-fmk bloqueou este efeito (tratamento P<0,05; inibidor P<0,001). O experimento foi repetido 5 vezes usando 22-26 embriões por tratamento. No experimento 4, os efeitos do TNF-α na atividade da caspase-9 foram avaliados. Embriões nos estágios de mórula e blastocisto inicial foram coletados no dia 6 e transferidos para um novo meio de KSOM-BE2 contendo 10 ng/mL ou Tris-HCL (veículo) a 38,5°C por 3, 6, 9, 12, and 15 h, após este período a atividade da caspase-9 foi classificada como descrito anteriormente. O experimento foi repetido 8 vezes utilizando 37-39 embriões por tratamento. A proporção de embriões classificados como tendo média ou alta atividade da caspase-9 aumentou nos grupos com TNF-α em todos os períodos, exceto 3 h (tratamento P < 0,02). No Experimento 5 avaliou-se os  efeitos do estresse térmico e TNF-α na integridade da membrana da mitocondria. Embriões com 3 ½ foram selecionados e cultivados em novo KSOM-BE2 ± 10 ng/mL TNF-α a 38,5 °C por 24 h ou 41 °C por 15 h seguindo de 9 h a 38,5 °C. Após os tratamentos, os embriões foram lavados e incubados em 20 nM DiOC6 por 20 min. Através de fotos avaliou-se a quantidade de unidades fluorescentes por área em cada embrião. Embriões mantidos a 41 °C mostraram uma significante perda no potencial da membrana quando comparados ao controle (P < 0,05). Embriões cultivados com TNF-α apresentaram uma discreta perda no potencial da membrana, porém, não foi significativa. Conclui-se que a ativação da caspase-9 está envolvida no mecanismo de indução da apoptose pelo estresse térmico e TNF-α em embriões bovinos.